La forma general del daño tisular inducido por hiperglucemia se muestra esquemáticamente en la Fig. 1. El DCCT (Diabetes Control and Complications Trial) y el UKPDS (U.K. Prospective Diabetes Study) establecieron que la hiperglucemia, es la causa iniciadora del daño tisular por diabetes que vemos clínicamente (1,2). Aunque este proceso es modificado por determinantes de susceptibilidad genética o individual, y por factores independientes aceleradores como la hipertensión, nos concentraremos en los mecanismos que median el efecto hiperglucémico del daño tisular.
Cuando nos referimos a los efectos de daño tisular por hiperglucemia, por supuesto, hablamos de daño a un tipo particular de células: las células endoteliales de la retina, las mesangiales del glomérulo renal, y neuronas y células de Schwann de nervios periféricos. ¿Qué las hace a estas células tan vulnerables a la hiperglucemia? Sabemos que la hiperglucemia en los pacientes con diabetes mellitus (DM) baña todas las células de cada tejido. Entonces, ¿por qué el daño ocurre en unas pocas células? La respuesta es que la mayoría de las células son capaces de reducir el transporte de glucosa al interior cuando son expuestas a hiperglucemia, de modo que su concentración interna de glucosa permanece constante. En contraste, las células dañadas por la hiperglucemia no pueden hacer esto eficientemente (3,4). Por la tanto, se dañan selectivamente las células cuyo transporte de glucosa no declina rápidamente con la hiperglucemia produciendo un alto nivel de glucosa en su interior. Esto es importante, pues nos dice que la explicación de lo que causa las complicaciones está dentro de la célula, no fuera.
Figura 1.
Características Principales del Daño Tisular Inducido por Hiperglucemia.
El primero de tales mecanismos que fue descubierto fue la vía de los polioles y el aumento del flujo en la via de los polioles (5). Luego, alrededor de 10 años más tarde, se describió el aumento en la producción de productos avanzados de glicación (AGEs). A principios de 1990, una tercera pieza fue descubierta: activación inducida por la hiperglucemia de isoformas de la proteinquinasa C (PKC). Y a fines de 1990, una cuarta fue descubierta: aumento del flujo en la vía de la hexosamina y la consecuente sobremodificación de proteínas por N-acetylglucosamina.
Aumento del flujo en la vía de los polioles.
La vía de los polioles, mostrada esquemáticamente en Fig. 2, focaliza sobre la enzima aldosa reductasa. La aldosa reductasa normalmente tiene la función de reducir aldehídos tóxicos de la célula a alcoholes inactivos, pero cuando la concentración de glucosa aumenta, también reduce glucosa a sorbitol, que más tarde es oxidado a fructuosa. En el paso de reducir glucosa a sorbitol, la enzima consume el cofactor NADPH como se muestra en la Fig. 2. NADPH es también cofactor esencial para regenerar un crítico antioxidante intracelular, glutatión reducido. Por reducir la cantidad de glutation reducido, la vía de los polioles incrementa la susceptibilidad intracelular al stress oxidativo.
¿Como sabemos que esto es realmente importante? Por estudios en los cuales perros con DM fueron tratados por 5 años con un inhibidor de aldosa reductasa (7). La velocidad de conducción nerviosa decrecía con el tiempo, al igual que sucede con los pacientes, en los perros con DM. En contraste, los perros tratados con el inhibidor de aldosa reductasa, ese defecto en la conducción nerviosa fue prevenido.
Figura 2.
La Hiperglucemia Aumenta el Flujo a Través de la Vía de los Polioles.
From Brownlee M: Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 414:813–820, 2001.
Figura 3.
ProducciónAumentada de AGE y sus Consecuencias Patológicas.
From Brownlee M: Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 414:813–820, 2001.
Activación de PKC.
En esta vía mostrada esquemáticamente en la Fig. 4, la glucosa aumentada dentro de la célula incrementa la síntesis de diacilglicerol (DAG), que es un cofactor críticamente activador para las isoformas clásicas de la PKC (beta, delta y alfa) (23–26). Cuando PKC es activada tiene una variedad de efectos en la expresión genética. En cada caso, cosas que son buenas para una función normal están disminuidas y las que son malas están incrementadas. Por ejemplo, la producción del vasodilatador endotelial oxido nítrico (NO) por la sintetasa (eNOS) está disminuído, mientras el vasoconstrictor endotelina-1 (ET1) está aumentado. El factor de crecimiento transformante -ß (TGF ß) y PAI-1 están también aumentados. ¿Cómo sabemos que estos son importantes? Por muchos estudios animales, que demostraron que la inhibición de PKC previno cambios tempranos en la retina y riñon de los animales diabéticos (27,31,32).
Figura 4.
Consecuencias de la activación of PKC Inducida por la Hiperglucemia.
Como mostramos esquemáticamente en Fig. 5, cuando la glucosa aumenta dentro de la célula, la mayoría es metabolizada a través de la glucólisis, pasando primero por glucosa-6 fosfato, luego fructosa-6 fosfato y entonces por el resto de la vía glucolítica. Sin embargo, algo de la fructuosa-6-fosfato es derivada a una vía en la cual una enzima llamada GFAT (glutamina-fructosa-6-fosfato amidotransferasa) que convierte la fructosa-6-fosfato a glucosamina-6-fosfato y finalmente a UDP (uridin-difosfato) N-acetil-glucosamina.
Lo que sucede luego es que esta N-acetil glucosamina toma los residuos serina y treonina de factores de transcripción, justamente por fosforilación y esta sobremodificación por glucosamina comúnmente resulta en cambios patológicos en la expresión genética (33–35). Por ejemplo, en Fig. 5, un incremento de la transcripción del factor Sp1 resulta en aumento en la expresión del TGF-ß1 y PAI-1, ambos deletéreos para los vasos sanguíneos en pacientes con DM (36). Nuevamente, ¿cómo sabemos que esto es realmente importante? Ha sido demostrado que juega un rol en las anormalidades en la expresión genética de células glomerulares inducidas por hiperglucemia (33) y en la disfunción de cardiomiocitos inducidos por hiperglucemia en cultivos celulares (37). En placas de arteria carótida de pacientes con diabetes 2, está significativamente aumentada la modificación de proteínas en las células endoteliales (38).
Figura 5.
La Hiperglucemia Incrementa el Flujo Hacia la Vía de la Hexosamina.
From Brownlee M: Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 414:813–820, 2001.
Todas estas piezas del rompecabezas son importantes en la patogénesis de las complicaciones de la diabetes, pero hay dos cosas que sugieren que se está perdiendo algo importante. Primero, no había un elemento común uniendo estos mecanismos entre si. Segundo, fracasaron todos los trabajos clínicos con inhibidores de estas vías en pacientes. Buscándole un sentido a todo esto, creamos la hipótesis de que todos estos mecanismos estaban de hecho unidos en un evento superior común y que la falla para bloquear todas estas vías descendentes podría explicar el fracaso en los trabajos clínicos con inhibidores de únicas vías. Lo que descubrimos es que todos estos mecanismos reflejan un único proceso inducido por la hiperglucemia, y ese es el aumento en la producción de anión superóxido en la cadena de transporte de electrones mitocondrial.
¿Qué es lo que aumenta por la hiperglucemia intracelular en células cuyo transporte de glucosa no es down regulado por hiperglucemia pero que no está aumentado en células que si down regulan el transporte de glucosa?
La respuesta es un aumento en la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) (36,39). Aunque la hiperglucemia ha sido asociada con el stress oxidativo(40), ni el mecanismo subyacente ni el mecanismo que la produce ni sus consecuencias vía del daño hiperglucémico fueron descubiertos.
Cómo aumenta la hiperglucemia la producción de superóxido en la mitocondria?
En la cadena de transporte de electrones mitocondrial hay cuatro complejos proteicos llamados complejos I, II, III, y IV (Fig. 6). Cuando la glucosa es metabolizada en el ciclo de Krebs genera donadores de electrones. El principal es el NADH, quien entrega electrones al complejo I. El otro es el FADH2, formado por la succinato deshidrogenasa, quien dona electrones al complejo II. Los electrones de ambos complejos pasan a la coenzima Q, y luego son transferidos al complejo III, citocromo-C, complejo IV, y finalmente al oxígeno molecular generando agua.
Figura 6.
Producción de Superóxido en la Cadena Transportadora de Electrones Inducida por la Hiperglucemia.
Este sistema está organizado de este modo para mantener regulado el nivel de ATP en forma precisa. Mientras los electrones son transportados de izquierda a derecha, algo de su energía es utilizada para bombear protones a través de la membrana en los complejos I, III, y IV. Esto genera un gradiente de voltaje a través de la membrana mitocondrial cuya energía deriva de la síntesis de ATP por la ATP sintetasa (41,42). En forma alternativa las proteínas de desacoplamiento (UCPs) pueden descender ese gradiente para generar energía como un modo de mantener la generación de ATP constante.
Esto es lo que sucede en células normales. En contraste, en células expuestas a un aumento de la glucosa en su interior, hay más glucosa siendo oxidada en el ciclo de Krebs, generándose mayor cantidad de donadores de electrones (NADH y FADH2) en la cadena de transporte. Esto produce un aumento en el gradiente de voltaje transmembrana mitocondrial (43), causando el retorno de electrones a la coenzima Q, la cual pasándolos al oxígeno molecular genera superóxido (Fig. 6). La isoforma mitocondrial de superóxido dismutasa degrada éste a peróxido de hidrógeno, el cual es entonces convertido a H2O y O2 por otras enzimas.
¿Cómo sabemos que esto realmente sucede en las células que son dañadas por la hiperglucemia? Con la idea de demostrar esto, examinaremos el efecto de sobreexpresar UCP-1 o superóxido dismutasa (MnSOD) o generación de ROS inducido por hiperglucemia. La hiperglucemia aumentó la producción de ROS. En contraste eso no sucedió cuando a través de la sobrexpresión UCP colapsó el gradiente de voltaje mitocondrial (39). Lo mismo sucede cuando se produce la degradación del anión superóxido por sobreexpresión de la enzima MnSOD. Esto demuestra dos cosas: 1) El efecto UCP demuestra que la cadena de transporte de electrones mitocondrial es el origen del superóxido inducido por hiperglucemia. 2) Que el efecto de MnSOD demuestra que el ROS inicialmente formado es superóxido.
Para confirmar estos hallazgos se formaron células endoteliales llamadas celulas p0 que fueron deplecionadas de los genes que codifican para la cadena de transporte de electrones funcionante. Cuando esto sucede se anula el efecto de la hiperglucemia en la producción de ROS. De modo similar, tampoco se activan la vía de los polioles, formación de AGE, PKC, o la vía de hexosamina.
La hiperglucemia tampoco activa ninguna de estas vías cuando colapsa el gradiente de voltaje transmitocondrial por UCP o cuando el superóxido es degradado MnSOD. Hemos verificado todo eso en cultivos celulares de ratones transgénicos que sobreexpresan MnSOD.
Cuando animales salvajes se hacen diabéticos, todas las cuatro vías son activadas en tejidos donde ocurren las complicaciones. En contraste, cuando los ratones MnSOD transgénicos son hechos diabéticos, no se activa ninguna de ellas.
La activación de PKC y también del Factor Nuclear B (NF B), que activa muchos genes proinflamatorios en la vasculatura, fueron prevenidos por UCP-1 y MnSOD, en ambos, células endoteliales y en animales.
La superproducción de superóxido mitocondrial inducida por hiperglucemia activa las cuatro vías de daño por inhibición de las GAPDH.
La Figura 8 muestra un esquema propuesto por nosotros para unificar toda esta información. Este modelo está basado en información obtenida de observación efectuada por nosotros: animales y pacientes diabéticos, células con hiperglucemia, todos disminuyen la actividad de la gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa (GAPDH) enzima clave de la glicólisis, cuya inhibición por este mecanismo es prevenida por UCP-1 y MnSOD (36). ¿Qué sucede cuando la actividad de GAPDH es inhibida? Como vemos en Fig. 8, aumenta el nivel de todos los intermediarios de la glucólisis por encima de GAPDH. Este aumento de los intermediarios por encima activa dos de las cuatro vías antes señaladas: la de AGEs porque el precursor más importante de la vía, el metilglioxal, se forma del gliceraldehido-3-fosfato, así como también el diacilglicerol que activa la vía de PKC.
Figura 8.
La Sobreproducción Mitocondrial de Superóxido Activa las 4 Vías Mayores de Daño Hiperglucémico.
La fructosa-6-fosfato, metabolito más lejano por encima aumenta también, el cual aumenta el flujo a través de la vía de las hexosaminas, donde es convertido por la enzima GFAT a UDP–N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc).
Finalmente, aumenta la glucosa que produce un incremento en la vía de los polioles con el aumento en el consumo de NADPH en el proceso.
Para descartar la posiblidad de otros cambios metabólicos inducidos por hiperglucemia en estas observaciones, se inhibió la actividad de GAPDH, usando DNA antisense en células de cultivo expuestas a 90 mg/dl de glucemia, a niveles encontrados en células expuestas a hiperglucemia. Con la actividad de GAPDH reducida de tal modo, la actividad de las cuatro vías aumentó del mismo modo que sucede con la hiperglucemia (46).
La producción de superóxido mitrocondrial inducida por hiperglucemia inhibe la GADPH por activación de la PoliADP ribosa polimerasa.
A esta altura, sabemos que la hirperglucemia activa las cuatro vías por sobreproducción de superóxido en la mitocondria, el cual disminuye la actividad de la GAPDH. ¿Cómo hacen los ROS en células y tejidos para inhibir la actividad de GAPDH? Existen modificaciones químicas de GAPDH que correlacionaran con su disminución de actividad inducida por hiperglucemia. En Fig. 9, encontramos que esto se produce por polímeros de ADP-ribosa (46). Inhibiendo la producción mitocondrial de superóxido ya sea con UCP-1 o MnSOD, previnimos la modificación de GAPDH por ADP-ribosa y su reducción de actividad por hiperglucemia. Más importante aún, ambos fenómenos fueron prevenidos por un inhibidor específico de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), enzima que forma esos polímeros de ADP-ribosa.
Esto establece una relación causa-efecto entre la activación PARP y los cambios en GAPDH.
Figura 9.
El Daño del ADN Inducido por ROS Activa la PARP y Modifica la GADPDH.
¿Cómo activa la hiperglucemia la PARP, una enzima reparadora de DNA encontrada exclusivamente en el núcleo, y cómo la misma se une con GAPDH, enzima glucolítica que comúnmente se pensaba que reside en el citoplasma?
Normalmente, la PARP reside en el núcleo como forma inactiva, esperando ser activada por daño del DNA (Fig. 9). Cuando el aumento en la glucosa intracelular genera ROS en la mitocondria, encontramos que estos radicales libres inducen rupturas en el DNA, activando consecuentemente la PARP. Ambos procesos son prevenidos por UCP-1 o MnSOD (46). Una vez activada, PARP divide la molécula de NAD+ en sus dos componentes: ácido nicotínico y ADP-ribosa. PARP entonces procede a formar polímeros de ADP-ribosa, los que se acumulan en GAPDH y otras proteínas nucleares. GAPDH comúnmente reside exclusivamente en el citoplasma y juega un rol crítico en la reparación del DNA (47,48).
Cuando se desarrolla hiperglucemia en las células blanco de las complicaciones diabéticas, esto produce aumento intramitocondrial de la producción de ROS. Los ROS producen ruptura en el DNA nuclear lo cual activa PARP. PARP entonces modifica GAPDH, reduciendo en consecuencia su actividad. Finalmente, esto activa las cuatro vías mencionadas que producen daño celular.
Figura 10.
Mecanismo Unificado del Daño Celular por Hiperglucemia.
Cómo explica el mecanismo unificado el daño diabético macrovascular?
Datos provenientes del UKPDS han mostrado que la hiperglucemia no es el determinante mayor de la macroangiopatía diabética.
Para puntos finales microvasculares se observa un aumento de 10 veces el riesgo con un aumento de la HbA1c de 5.5 a 9.5%. En contraste solo se observa un aumento de dos veces para el riesgo macrovascular con el mismo rango de aumento en la HbA1c (2).
Si la hiperglucemia no es el mayor determinante de enfermedad macrovascular diabética, ¿qué pasa con la constelación de factores de riesgo asociados con insulinoresistencia (IR) y síndrome metabólico? Con la intención de separar el riesgo aumentado de enfermedad macrovascular debido a IR y sus anormalidades asociadas del riesgo aumentado por hiperglucemia, el San Antonio Heart Study estudió hombres sin diabetes o intolerancia a la glucosa (49). IR aumentó el riesgo CV dos veces. Luego de ajustar los 11 factores de riesgo CV conocidos, incluyendo LDL, HDL, TG, TAS, TBQ, los sujetos con IR todavía tenían un aumento de dos veces el riesgo de enfermedad CV. Esto sugirió que gran parte del riesgo CV debido a IR refleja una consecuencia inapreciada previamente de la misma.
La consecuencia no apreciada de la IR es un aumento del flujo de los ácidos grasos libres (FFA) desde los adipocitos hacia las células endoteliales como se en la Fig. 11. En células endoteliales macrovasculares, pero no en las microvasculares, se ha encontrado que este aumento del flujo de FFA resulta en un aumento de oxidación de los mismos en la mitocondria. Ya que la ß-oxidacíon de FFA-derivados trans-acetilCoA por el ciclo de Krebs genera los mismos donadores de electrones (NADH y FADH2) que los generados por la oxidación de la glucosa, el aumento de la oxidación de FFA causa sobreproducción mitocondrial de ROS por el mismo mecanismo que la hiperglucemia. Y por el mismo mecanismo antes explicado este aumento de ROS activa las mismas vías de daño celular. En modelos animales diabéticos no IR, la liberación de FFA por los adipocitos o bien la oxidación de los mismos en el endotelio arterial, previene el aumento de producción de los ROS y sus efectos dañinos.
Figura 11.
La IR Causa Sobreproducción ded ROS en las Células Endoteliales.
Activadores de transacetolasa.
Este concepto de tratamiento se origina de un obvio hallazgo obtenido en el mecanismo unificado (Fig. 8). Cuando el aumento del superóxido inhibe la actividad de GAPDH, los intermediarios glucolíticos por encima son desviados a las cuatro vías de daño hiperglucémico. Dos de esos intermediarios glucolíticos, fructuosa-6-fosfato y gliceraldehido-3-fosfato, son también productos finales de la reacción de la transacetolasa, que también es la enzima limitante en la vía de las pentosas (50). Aunque esta vía normalmente se piensa que fluye desde pentosa fosfatos hacia intermediarios glucolíticos, de hecho, también puede fluir desde intermediarios glucolíticos hacia pentosas fosfato, dependiendo de las concentraciones de sustratos presentados a la enzima trasacetolasa. Desde que sabemos que en diabetes, la concentración de los intermediarios glicolíticos es alta, pensamos que si pudiéramos activar la transacetolasa, entonces podríamos disminuir la concentración de estos dos metabolitos glucolíticos y entonces derivar su flujo fuera de las tres vía de daño normalmente activadas por hiperglucemia.
Sabiendo que esta enzima requiere la vitamina tiamina como cofactor, se han probado diferentes derivados de la tiamina y medido sus efectos. Mientras la misma tiamina sólo activa la transacetolasa 25% en células endoteliales, el derivado de tiamina llamado benfotiamina activa la transacetolasa 250% en células endoteliales arteriales. Basados en esos experimentos con cultivos celulares, se trataron ratas diabéticas con benfotiamina por 9 meses y se evaluó el efecto de este tratamiento en la retina. Luego de 9 meses de diabetes se observó un aumento de la actividad en la vía de hexosamina, en contraste los animales tratados con benfotiamina, mostraron una prevención completa de esta activación. Estos resultados fueron idénticos para el aumento de la formación de AGE, activación de PKC, y activación de NF B inducidos por hiperglucemia. Más importante aún, el tratamiento con benfotiamina previno completamente el daño estructural en lesiones tanto en retinopatía no proliferativa en humanos y en retinopatía diabética proliferativa en animales (50).
Inhibidores de PARP
La segunda clase de nuevos agentes con potencial terapéutico basado en el mecanismo unificado son los inhibidores de PARP. Desde que hemos demostrado que el aumento de superóxido en la mitocondria activa PARP, y la consecuente inhibición de GAPDH. (Fig. 9). La inhibición de PARP podría bloquear las cuatro vías más importantes del daño asociado a hiperglucemia. En cultivos de células endoteliales un inhibidor específico de PARP previene la activación inducida por hiperglucemia de PKC, NF B, formación intracelular de AGEs y la vía de hexosamina (46). En diabetes experimental de largo tiempo, el tratamiento con inhibidor de PARP previno completamente el daño estructural en lesiones tanto en retinopatía no proliferativa en humanos y en retinopatía diabética proliferativa en animales.
Antioxidantes Catalíticos.
Aunque las cuatro vías de daño han sido el foco principal en la investigación de complicaciones de los últimos 40 años, es importante reconocer que el exceso de superóxido en si mismo puede inhibir directamente enzimas endoteliales críticas sin involucrar ninguno de estos cuatro mecanismos. Dos de esas enzimas particularmente importantes para la biología endotelial son eNOS y la prostaciclina sintetasa. Ambas son inhibidas dramáticamente en pacientes diabéticos y en animales.
eNOS es una enzima antiaterogénica muy importante con gran relevancia en la macroangiopatía diabética. Prostaciclina sintetasa es otra enzima endotelial antiateroesclerótica crítica.
Para prevenir la inactivación oxidativa directa de estas enzimas clave, debemos directamente reducir la cantidad de superóxido. Sin embargo los antioxidantes convencionales no pueden hacer esto efectivamente. Pues los antioxidantes convencionales neutralizan las moléculas reactivas de oxigeno una a una, mientras que la sobreproducción de superóxido inducida por hiperglucemia es un proceso contínuo. Se necesita entonces un nuevo tipo de antioxidante, catalítico, tal como un SOD/catalasa mimético (53), que trabaje continuamente como las enzimas por las cuales estos compuestos son producidos.
La sobreproducción de ROS por hiperglucemia reduce directamente la actividad de eNOS en aortas diabéticas en un 65%. Sin embargo, cuando estos animales diabéticos son tratados con un SOD/catalasa mimético, no hay reducción de actividad en esta enzima antiaterogénica. De modo similar, pero más dramáticamente, la sobreproducción de ROS por hiperglucemia reduce directamente la actividad de la prostaciclina sintetasa en aortas diabéticas en un 95%. El tratamiento de estos animales diabéticos con un SOD/catalasa mimético previene completamente la inactivación oxidativa de la prostacilina sintetasa aórtica.
Estos datos sugieren fuertemente que la corrección terapéutica de la producción de superóxido inducida por diabetes puede ser un poderoso tratamiento para prevenir complicaciones diabéticas.
Fuente.
Banting Lecture 2004
The Pathobiology of Diabetic Complications
A Unifying Mechanism
Michael Brownlee.
Traducción Dr. Martín Maraschio.
Jefe de Residentes de Clínica Médica.
Hospital Municipal "Dr.Ángel Pintos" de Azul.
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